PREPARACIONES EN FRESCO II

PRACTICA DE LABORATORIO N°4

MONTAJE DE PREPARACIONES EN FRESCO: CELULA VEGETAL Y VISUALIZACION DE ESTRUCTURAS MICOTICAS

OBJETIVOS

• Aprender a montar preparaciones frescas
• Observar células vegetales y hongos, describiendo las estructuras visibles al microscopio óptico
• Reconocer la estructura básica de las células vegetales y de de las estructuras micoticas
• Observar la morfología de los hongos

MARCO TEORICO

La observación microscópica constituye la primera etapa del estudio de los microorganismos y también del diagnóstico microbiológico ya que permite conocer algunas características de los microorganismos, como ser: forma, disposición o agrupación, presencia o ausencia de estructuras (cápsulas, esporas, flagelos), movilidad, etc.

Las células son de tamaño, forma y funciones muy variadas, todo depende del trabajo que les toque realizar, sin embargo desde el punto de vista estricto de su forma y grado de complejidad las células se pueden dividir en:

Células Procariotas:

• Son primitivas, poco evolucionadas
• Carecen de membrana nuclear, el material genético se encuentra disperso en el citoplasma.
• Carecen de organelas básicas, tales como: Mitocondrias, retículo endoplasmático, complejo de golgi, etc., pero si poseen numerosas ribosomas para la síntesis de proteínas

 Células Eucariotas:

·         Son más evolucionadas y estructuralmente más complejas.

·         El material genético está encerrado por un núcleo

·         Posee organelos citoplasmáticos.

Las células de los integrantes del reino Animal pueden ser geométricas, como las células planas del epitelio; esféricas, como los glóbulos rojos; estrelladas, como las células nerviosas, o alargadas, como las células musculares. La diversidad también se extiende a los tamaños: varían entre los 7,5 micrómetros de un glóbulo rojo humano, hasta unos 50 centímetros, como ocurre con las células musculares.

Para poder observar al microscopio células, tejidos animales o vegetales y microorganismos es necesario hacer preparaciones sobre portaobjetos. Hacer una preparación consiste por lo tanto en colocar y extender el tejido o la muestra sobre un portaobjetos, cubriéndolo después con un cubreobjetos. Las preparaciones pueden ser temporales, frescas y permanentes. Las primeras son aquellas que solo se van a utilizar durante la práctica, unos días; las frescas se usan solo durante la práctica y posteriormente se lavan. Y las permanentes son aquellas preparaciones que duran “para siempre”, por lo que deben hacerse con un material especial (bálsamo de Canadá) para que el cubre-objetos permanezca perfectamente adherido al porta-objetos, durante años.

CÉLULA VEGETAL

Estas células forman parte de los tejidos y órganos vegetales. La presencia de los cloroplastos, de grandes vacuolas y de una pared celular que protege la membrana celular son tres las características que diferencian una célula vegetal de una animal. La pared celular de las células vegetales es rígida, lo que determina las formas geométricas que encontramos en los tejidos vegetales, como el hexagonal observado en las células de la cubierta de las cebollas.

La forma y la estructura de una célula están generalmente relacionadas con la función que realizan. El agua del suelo se mueve hacia arriba a través del tallo por medio de células; algunas de ellas son largas y de baja consistencia, con paredes engrosadas hacia el interior para formar un espiral. Otras células de una planta están especializadas y tienen por tanto características morfofisiológicas especificas.

HONGOS

Los hongos son un reino de seres vivos unicelulares o pluricelulares que no forman tejidos y cuyas células se agrupan formando un cuerpo filamentoso muy ramificado

Los hongos tienen alimentación heterótrofa, puesto que no pueden realizar la fotosíntesis porque no tienen clorofila. Tienen digestión externa, pues vierten al exterior enzimas digestivas, sustancias proteicas que actúan sobre los alimentos dividiéndolos en moléculas sencillas, que atacan a los alimentos. Los hongos absorben los alimentos después de digerirlos.

 Según su tipo de vida, los hongos pueden ser saprofitos, parásitos y simbiontes. Los hongos saprofitos, como el champiñón o la trufa, se alimentan de sustancias en descomposición. Los hongos parásitos se alimentan de los líquidos internos de otros seres vivos. Los hongos simbiontes se asocian con otros organismos y se benefician mutuamente.

 Los hongos viven en lugares húmedos, con abundante materia orgánica en descomposición y ocultos a la luz del sol. También pueden habitar medios acuáticos o vivir en el interior de ciertos seres vivos parasitándolos

Es una observación cotidiana el hecho que si se deja un trozo de pan en un lugar húmedo, con el paso del tiempo es probable que crezca sobre él una pelusa blanca que luego se oscurece, correspondiente al hongo Rhyzopus stolonifer (o “moho negro del pan”). Esa pelusa es el micelio del hongo, y su oscurecimiento se debe a la formación de esporangios, estructuras que dan lugar a millones de esporas (una forma de reproducción de éstos organismos) Los principales métodos aplicados para la observación microscópica de los cultivos son: la observación en fresco con una solución adecuada, y las preparaciones en cinta adhesiva.

MATERIALES Y METODOS

• Hojas de elodea 
• Cebolla
• Alimento con hongos (fruta, verdura, pan)
• Microscopio
• caja de Petri
• tijeras
• bisturí
• Laminas portaobjetos
• Laminas cubreobjetos
• Solución fisiológica o salina
• Azul de metileno
• Lugol
• KOH 10%
• Cinta adhesiva
• verde de metilo acético
• solución de lactofenol
• Bajalenguas o hisopos
• Goteros
• Tijeras
• Lancetas esteriles
• palillos

CELULAS VEGETALES

1.         Limpiar la cebolla de las hojas exteriores secas

2.    Tome  la cebolla  y sobre la epidermis de la misma utilizando la cuchilla, haga un corte delgado

3.    De la parte cóncava de una de las hojas carnosas del bulbo de la cebolla y con la ayuda de un bisturí y una pinza fina, separar una pequeña porción de epidermis, procurando no arrancar el tejido subyacente, de tal forma que la parte desprendida tenga el aspecto de una fina película traslúcida como el celofán

4.    Llevar el trozo desprendido a la cubeta o caja de Petri con agua. Apoyar el portaobjeto en el fondo de la caja y ayudándose con la pinza extender el trocito de epidermis de cebolla sobre el porta.

5.    Añadir unas gotas de verde de metilo acético o azul de metileno o lugol o agua dejando actuar este colorante-fijador durante cinco minutos, procurando añadir más gotas si se evapora

6.    Escurrir el colorante sobrante y lavar, dejando caer agua con un gotero sobre la preparación.

7.    Colocar encima de la preparación un cubreobjetos y observar al microscopio, primero a pequeño aumento y luego a un aumento mayor con el fin de centrar la preparación y determinar la zona mejor para la visualización. Cambiar después a un aumento mayor

Las células de la epidermis de las hojas internas del bulbo de la cebolla, son de forma alargada y bastante grande. La membrana celular celulósica se destaca muy clara teñida por el colorante. Los núcleos son grandes y muy visibles. En el citoplasma se distinguen algunas vacuolas grandes débilmente coloreadas

OBSERVACIÓN DE TEJIDO EPIDERMAL Y PARÉNQUIMA CLOROFÍLICO EN HOJA DE ELODEA

Para observación de tejido epidermal y parénquima clorofílico utilice  una  hoja de Elodea:

1.    Tome con la pinza una ramita de Elodea y corte con las tijeras una hojita.

2.   Extiéndala sin invertirla sobre una lámina portaobjetos, adicione una gota de agua y cúbrala    con una laminilla.

3.    Observe detenidamente a través del microscopio con aumento 10x, 40x . Anote sus
observaciones

OBSERVACION MICROSCOPICA DE HONGOS

1. Colocar sobre un portaobjetos una gota de solución de lactofenol no demasiado grande para evitar que el cubreobjetos flote y la preparación quede demasiado gruesa.
2. Cortar un trozo de cinta adhesiva transparente de aproximadamente 2cm.
3. Tocar con el lado adhesivo de la cinta la superficie de la fruta o el pan enmohecidos o el borde de una colonia de hongo de un cultivo. En la zona central de una colonia puede haber una excesiva concentración de esporas.
4. Pegar la cinta adhesiva sobre la gota del portaobjetos.
5. Eliminar el colorante sobrante con un papel de filtro.

OBSERVACIÓN EN FRESCO DE HONGOS


Deposite una gota de agua O KOH 10% sobre un portaobjeto y posteriormente con un palillo o lanceta esteril, proceda a sacar el hongo (micelio, esporas, etc.) del sustrato en el cual el microorganismo se está desarrollando

1. Separe suavemente el micelio en la gota de agua sobre el portaobjeto ayudándose con otra aguja.
2. Coloque el cubreobjeto sobre la gota de agua en un ángulo de 45° y déjelo caer sobre ésta asegurándose que no queden burbujas

CUESTIONARIO

1. Dibuje una célula vegetal. Distinga sus organelos y función
2. Defina y dibuje un Aspergillus y un Penicillum
3. Para qué sirve el KOH al 10% en la visualización de estructuras micoticas
4. Defina: miscelio, hifas septadas, levaduras, blastoconidias

BIBILIOGRAFIA

Piña Lopes, E,E. Salazar Nuñes, Y. Avila Garcia, B. Guía de Laboratorio de Biología, Escuela de Ciencias Básicas, Tecnología e Ingeniería, Universidad Nacional Abierta y a Distancia

Morales J. Laboratorio de Biología, , Universidad Libre, Facultad de Ingeniería.

Solis Rojas J.l, Manual de Practicas de Biología General, Universidad Nacional del Centro del Perú, Facultad de Ingenierías en Industrias Alimentarias