MICROSCOPIA

PRACTICA DE LABORATORIO N° 2
MICROSCOPIA

OBJETIVOS

• Identificar cada una de las partes del microscopio y aprender a utilizarlos correctamente
• Formular y  enumerar los cuidados básicos que se debe tener en cuenta en el uso y manejo del microscopio durante las sesiones de practica

MARCO TEORICO

EL MICROSCOPIO

El microscopio es un instrumento diseñado para ser posible la observación y examen de seres muy pequeños o los elementos formativo de uno de ellos y que están fuera de la visibilidad adecuada del ojo humano. Hay varios tipos de microscopio, los más usados y conocidos son los microscopios simples o lupa, los microscopios compuestos y el microscopio binocular estereoscopio, luego podemos encontrar otros tipos de uso más especializado en determinados campos de la biología y otras ciencias. El más revolucionario en el campo biológico es el microscopio electrónico que usa como fuente de funcionamiento un chorro de electrones

El  microscopio simple (de un lente o varios lentes), es un instrumento que amplifica una imagen y permite la observación de mayores detalles de los posibles a simple vista. El microscopio más simple es una lente de aumento o un par de anteojos. El poder de resolución del ojo humano es de 0,2 mm es decir que para ver dos objetos separados estos deben estar como mínimo a esa distancia.

El microscopio aumenta la imagen hasta el nivel de la retina, para captar la información. La resolución depende de la longitud de onda de la fuente luminosa, el espesor del espécimen o muestra, la calidad de la fijación y la intensidad de la coloración.

Teóricamente la máxima resolución que se puede alcanzar es de 0,2 um dada por una luz con longitud de onda de 540 nm, la cual pasa por un filtro verde (muy sensible por el ojo humano) y con objetos condensadores adecuados. El ocular aumenta la imagen producida por el objetivo, pero no puede aumentar la resolución.

Existen distintos microscopios ópticos generales y de investigación que se diferencian en factores tales como la longitud de onda de la iluminación, del espécimen o muestra , la alteración física de la luz que incide en la muestra y procesos analíticos que se aplican a la imagen final.

Microscopio compuesto

SISTEMA ÓPTICO

OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del objetivo.

OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta.

CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación.

DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.

FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.

SISTEMA MECÁNICO

SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo.

PLATINA: Lugar donde se deposita la preparación.

CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular

REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos.

TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima el enfoque y micrométrico que consigue el enfoque correcto.

MATERIALES Y METODOS

• Microscopio
• Aceite de inmersión
• Xilol
• Papel filtro o papel de arroz
• Papel milimetrado
• Letra “e” minúscula recortada de periódico o revista
• Hebras de hilo
• Recorte de una figura o foto de revista
• Laminas portaobjetos
• Laminas cubreobjetos
• Gotero

1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya debería estar en esas condiciones.

2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas

3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias.

4. Para realizar el enfoque:

1. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del  ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos.
   
   
2. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítida la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino.

5. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. El  objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es   fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión (100x)

Para realizar el proceso descrito anteriormente se utilizara como muestra o preparación una letra “e” minúscula y una hebra de hilo, las cuales se colocaran sobre el centro de un portaobjetos con el lado de debajo de la letra hacia arriba en el caso de la “e” minúscula. Ponga una gota de agua sobre la muestra. Después de esperar unos segundos hasta que el agua haya empapado el papel, coloque la laminilla (cubreobjetos) sobre la preparación, si quedan algunas burbujas de aire se presiona ligeramente la laminilla con un lápiz hasta que desaparezcan y continúe con el proceso


          6.  Dibujar lo que observa en cada aumento observado

Empleo del objetivo de inmersión (100x) : Bajar totalmente la platina

1. Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite.
2. Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión
3. Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre la muestra en la lámina portaobjetos.
4. Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión
5. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente.
6. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande
7. Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación desde el paso 3.
8. Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación.
9. Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica. Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente limpio.

Para realzar el proceso descrito anteriormente se usan preparaciones fijas previamente coloreadas. Dibujar lo observado.

Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posición de observación, asegurarse de que la parte mecánica de la platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda

CAMPO VISUAL

El campo de visión de un microscopio es la zona circular que se observa al mirar la preparación bajo un determinado aumento. Para medir el campo de visión de un microscopio, se debe usar una unidad llamada micra. Una micra equivale a 0,0001 mm; en otras palabras, hay 1000 micras en un milímetro. El diámetro de este campo es su medida.

Para calcular el diámetro del campo de visión para un determinado aumento hay que seguir los siguientes pasos:

•  Recorte un cuadrado de 1 cm de lado de papel milimetrado

•  Ponerlo sobre la abertura central del portaobjeto

•  Observando por el ocular y con el objetivo de 4X, mover  la muestra hasta lograr que la     línea 0 mm quede en el borde izquierdo del campo visual

• Enfocar con el objetivo de menor aumento 4X hasta que se vea con claridad. Enfocar la preparación  quiere decir situarla a la distancia del objetivo que permite su observación nítida. Esta distancia se conoce como distancia de trabajo y es tanto menor cuanto mayor es el poder de aumento del objetivo

•  Medir el campo visual haciendo coincidir una de las líneas del papel milimetrado con el borde del campo de visión

• Contar el número de milímetros que se ven (recuerde que la distancia entre dos líneas es un milímetro) y estimar aproximadamente la fracción sobrante, si la hay. El resultado será el diámetro del campo visual para ese aumento (objetivo x ocular).

• Si queremos calcular el diámetro del campo de visión para aumentos mayores, hay que tener en cuenta que cuanto mayor sea el aumento, el campo será menor, es decir, se verá menos de la muestra que estemos observando. De forma que, si el aumento es el doble, el campo será la mitad, si el aumento es el triple, el diámetro será la tercera parte, etc. (inversamente proporcionales). Por tanto, bastará con realizar un sencillo cálculo matemático para saber el nuevo diámetro.

•  Dibujar lo observado 

RECOMENDACIONES

ü  Cuando no se está utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se ensucien y dañen las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo.

ü  Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de óptica.

ü  No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está utilizando el microscopio

ü  Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el aceite que queda en el objetivo con pañuelos especiales para óptica o con papel de filtro (menos recomendable). En cualquier caso se pasará el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden dañar las lentes y su sujeción.

ü  No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico, micrométrico, platina, revólver y condensador).

ü  El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se está observando a través del ocular.

ü  Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algún líquido, secarlo con un paño. Si se mancha de aceite, limpiarla con un paño humedecido en xilol.

CUESTIONARIO

1. Explique brevemente la definición del microscopio y su finalidad
2. Identifica en un grafico  un microscopio compuesto y todas sus partes
3. Describa los diferentes tipos de microscopios
4. Explique la trayectoria del rayo de luz a través del microscopio y por que se invierte la imagen que observamos
5. Defina: poder de definición del microscopio, poder de penetración o profundidad, poder de resolución, campo de visión
6. Como se determina el aumento total (Xt) del microscopio óptico compuesto
7. Por que se usa aceite de inmersión para utilizar el objetivo de 100x?

ANEXOS


http://www.unad.edu.co/curso_biologia/video_microscopio1.htm
http://www.unad.edu.co/curso_biologia/video_microscopio2.htm
http://canal.unad.edu.co/laboratorio/index/main.html


BIBILIOGRAFIA

Pelaez Garavito, I y Marulanda Ángel M.L. Texto Guia de Biología General y Laboratorio

Morales J. Laboratorio de Biología, , Universidad Libre, Facultad de Ingeniería.

Solis Rojas J.l, Manual de Practicas de Biología General, Universidad Nacional del Centro del Perú, Facultad de Ingenierías en Industrias Alimentarias

Correa M. L. Laboratorio de Biología Vegetal y Ecologia. Universidad del Valle,

Facultad de ingenieria

Piña Lopes, E,E. Salazar Nuñes, Y. Avila Garcia, B. Guía de Laboratorio de Biología, Escuela de Ciencias Básicas, Tecnología e Ingeniería, Universidad Nacional Abierta y a Distancia